Berechnungen der Enzymrückgewinnung bei der Flüssig-Flüssig-Extraktion werden durch die Erhaltung des gelösten Stoffes, das Phasengleichgewicht und die Phasenstromraten bestimmt. Für einen wässrigen Zulauf, der mit einem nicht mischbaren Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, wird die Enzymrückgewinnung berechnet, indem das eintretende Enzym mit der im wässrigen Raffinat verbleibenden Menge verglichen wird. Die zentrale Gleichgewichtsbeziehung ist das Verteilungsverhältnis (D=C_{\text{org}}/C_{\text{aq}}), kombiniert mit den wässrigen und organischen Durchflussraten.

Das grundlegende Prinzip ist einfach: Das in die organische Phase extrahierte Enzym entspricht dem mit dem Zulauf eintretenden Enzym abzüglich des im Raffinat austretenden Enzyms, sofern Verluste, Abbau und Phasenmitnahme vernachlässigbar sind.

Die Stoffbilanz definiert die Rückgewinnung

Mit der Enzym-Zulaufrate beginnen

Die in die Extraktionseinheit eintretende Enzymmenge wird aus der wässrigen Zulaufstromrate und der Enzymkonzentration bestimmt:

[ \dot{m}{\text{feed}}=Q{\text{aq}}C_{\text{feed}} ]

Hierbei ist (Q_{\text{aq}}) die wässrige Zulaufstromrate und (C_{\text{feed}}) die Enzymkonzentration in diesem Zulauf.

Die Einheiten müssen konsistent sein. Beispielsweise ergeben eine volumetrische Durchflussrate in Litern pro Minute und eine Konzentration in Gramm pro Liter eine Enzym-Zulaufrate in Gramm pro Minute.

Beide Auslassströme berücksichtigen

Unter stationären Bedingungen lautet die Enzymbilanz:

[ Q_{\text{aq}}C_{\text{feed}}

Q_{\text{aq}}C_{\text{aq}} + Q_{\text{org}}C_{\text{org}} ]

Der erste Auslassterm stellt das im wässrigen Raffinat verbleibende Enzym dar. Der zweite beschreibt das in den organischen Extrakt übertragene Enzym.

Diese Bilanz setzt voraus, dass die wässrigen und organischen Durchflussraten bekannt sind und dass durch die gegenseitige Löslichkeit der Phasen verursachte Volumenänderungen gering sind oder bereits in den gemessenen Auslassströmen berücksichtigt werden.

Die extrahierte Enzymrate berechnen

Die Rückgewinnungsrate des Enzyms in die organische Phase beträgt:

[ \dot{m}{\text{org}}=Q{\text{org}}C_{\text{org}} ]

Äquivalent dazu unter Verwendung des Raffinatstroms:

[ \dot{m}_{\text{org}}

Q_{\text{aq}} \left(C_{\text{feed}}-C_{\text{aq}}\right) ]

Diese beiden Ausdrücke sollten übereinstimmen, wenn die Messungen und Bilanzannahmen zuverlässig sind.

Das Verteilungsverhältnis verbindet die Phasen

Die Gleichgewichtsbeziehung definieren

Das Verteilungsverhältnis lautet:

[ D=\frac{C_{\text{org}}}{C_{\text{aq}}} ]

Daraus folgt:

[ C_{\text{org}}=D C_{\text{aq}} ]

Ein größerer Wert von (D) zeigt an, dass sich das Enzym unter den Betriebsbedingungen bevorzugt in die organische Phase verteilt. Der Wert ist bei unterschiedlichen pH-Werten, Temperaturen, Lösungsmittelzusammensetzungen oder Enzymformen nicht unbedingt konstant.

Die Rückgewinnung bei einem Einzelkontakt herleiten

Durch Einsetzen der Verteilungsbeziehung in die Stoffbilanz erhält man:

[ Q_{\text{aq}}C_{\text{feed}}

Q_{\text{aq}}C_{\text{aq}} + Q_{\text{org}}D C_{\text{aq}} ]

Durch Auflösen nach der Konzentration des wässrigen Raffinats:

[ C_{\text{aq}}

\frac{Q_{\text{aq}}C_{\text{feed}}} {Q_{\text{aq}}+D Q_{\text{org}}} ]

Die entsprechende organische Konzentration ist:

[ C_{\text{org}}

D\frac{Q_{\text{aq}}C_{\text{feed}}} {Q_{\text{aq}}+D Q_{\text{org}}} ]

Diese Gleichungen beschreiben einen idealen Gleichgewichtskontakt mit vernachlässigbarem Enzymverlust und ohne signifikante Lösungsmittelmitnahme.

Die Rückgewinnung als Bruchteil ausdrücken

Der Anteil des in der organischen Phase zurückgewonnenen Enzyms beträgt:

[ \phi

\frac{Q_{\text{org}}C_{\text{org}}} {Q_{\text{aq}}C_{\text{feed}}} ]

Das Einsetzen der Gleichgewichtsausdrücke ergibt:

[ \phi

\frac{D Q_{\text{org}}} {Q_{\text{aq}}+D Q_{\text{org}}} ]

Die prozentuale Rückgewinnung beträgt:

[ \text{Recovery (%)}

100\phi ]

Diese Form zeigt, dass die Rückgewinnung sowohl vom Verteilungsverhältnis als auch vom Verhältnis der Lösungsmittel- zur Zulaufstromrate abhängt, nicht allein von (D).

Durchflussverhältnisse bestimmen den Lösungsmittelbedarf

Das Verhältnis von Lösungsmittel zu wässriger Phase interpretieren

Das Verhältnis von Lösungsmittel zu Zulauf wird definiert als:

[ S=\frac{Q_{\text{org}}}{Q_{\text{aq}}} ]

Die Rückgewinnungsgleichung lautet dann:

[ \phi=\frac{DS}{1+DS} ]

Diese Beziehung ist für die Planung von Pilotanlagen nützlich. Eine Erhöhung des Lösungsmittelstroms steigert im Allgemeinen die Rückgewinnung, wobei der Zugewinn mit zunehmendem (DS) schrittweise geringer wird.

Die Bedeutung des Raffinats erkennen

Dieselbe Rückgewinnung kann aus dem im wässrigen Raffinat verbleibenden Enzym berechnet werden:

[ \phi

1-\frac{Q_{\text{aq}}C_{\text{aq}}} {Q_{\text{aq}}C_{\text{feed}}} ]

Für ein System mit konstantem wässrigem Durchfluss:

[ \phi

1-\frac{C_{\text{aq}}}{C_{\text{feed}}} ]

Dies ist häufig die praktischste Berechnung, wenn Raffinatproben leichter zu analysieren sind als Proben der organischen Phase.

Die Rückgewinnung in den Durchsatz umrechnen

Der Rückgewinnungsanteil und die Rückgewinnungsrate sind unterschiedliche Größen. Der Anteil beschreibt die Prozessleistung, während die Rückgewinnungsrate des Enzyms die Produktionskapazität beschreibt:

[ \dot{m}_{\text{recovered}}

\phi Q_{\text{aq}}C_{\text{feed}} ]

Eine Pilotanlage kann daher eine hohe prozentuale Rückgewinnung erzielen und gleichzeitig zu wenig Zulauf verarbeiten, um die Produktionsanforderungen zu erfüllen. Für Scale-up-Entscheidungen werden beide Kennzahlen benötigt.

Mehrstufige Anlagen erfordern stufenweise Bilanzen

Die Bilanz auf jede Stufe anwenden

Ein einzelner Gleichgewichtskontakt ist ein idealisiertes Modell. In einer Gegenstromkolonne, einer gepackten Extraktionseinheit oder einem mehrstufigen Kontaktapparat besitzt jede Stufe eigene Ein- und Austrittskonzentrationen, Strömungsbedingungen und einen eigenen Stoffübergangsgrad.

Stufenweise Berechnungen verwenden Komponentenbilanzen zusammen mit Gleichgewichtsbeziehungen, Verbindungsgeradendaten oder gemessenen Stufeneffizienzen. Die Gesamtrückgewinnung wird aus der Endkonzentration des Raffinats bestimmt:

[ \phi

\frac{F x_F-R_n x_n} {F x_F} ]

Hierbei ist (F x_F) die mit dem Zulauf eintretende Menge an Enzym oder gelöstem Stoff, und (R_n x_n) die im Endraffinat austretende Menge.

Ideale und tatsächliche Rückgewinnung unterscheiden

Die theoretische Rückgewinnung in mehrstufigen Systemen setzt ein spezifiziertes Gleichgewichtsverhalten und eine ideale Stufenleistung voraus. Die experimentelle Rückgewinnung kann geringer sein, weil die Phasen das Gleichgewicht nicht erreichen, die Durchmischung unvollständig ist, die Verweilzeit nicht ausreicht oder die Phasentrennung unvollkommen ist.

Der Vergleich zwischen theoretischer und gemessener Rückgewinnung hilft, Stoffübergangslimitierungen und Ineffizienzen der Anlage zu identifizieren.

Die Phasentrennung in die Berechnung einbeziehen

Der Extraktionsschritt überträgt Enzym zwischen den Phasen, doch anschließend muss der Dekanter, Abscheider oder die Zentrifuge diese Phasen wirksam trennen. In das Raffinat mitgerissene organische Tröpfchen oder in den Extrakt mitgerissene wässrige Tröpfchen können die gemessenen Konzentrationen verfälschen und scheinbare Rückgewinnungsverluste verursachen.

Berechnungen in Pilotanlagen sollten daher die tatsächliche Verteilung von Verlusten durch Mitnahme, Emulsionsbildung oder unvollständige Phasentrennung unterscheiden.

Betriebsbedingungen verändern das Verteilungsverhältnis

pH-Wert und Enzymspezies kontrollieren

Bei ionisierbaren Biomolekülen kann der pH-Wert den Ladungszustand des Enzyms und damit seine relative Löslichkeit in den beiden Phasen verändern. Eine pH-Anpassung kann die Extraktion verbessern, doch übermäßige pH-Änderungen können die Enzymaktivität oder -stabilität verringern.

Das relevante (D) muss beim tatsächlichen BetriebspH gemessen oder validiert werden, anstatt von einer anderen Bedingung übernommen zu werden.

Temperatur und Lösungsmittelwahl berücksichtigen

Die Temperatur beeinflusst sowohl die Gleichgewichtsverteilung als auch die Enzymstabilität. Organische Lösungsmittel können Enzyme außerdem denaturieren, selbst wenn sie günstige Verteilungskoeffizienten bieten.

Für empfindliche Enzyme können wässrige Zweiphasensysteme auf Basis von Polymeren wie PEG und Dextran eine schonendere Alternative darstellen. Die Rückgewinnung und Rückführung der Polymere können dann wichtige Bestandteile der Prozesswirtschaftlichkeit werden.

Die Annahme der Nichtmischbarkeit überprüfen

Die grundlegenden Gleichungen setzen voraus, dass die Phasen getrennt bleiben und dass die Durchflussraten den tatsächlichen Phasenströmen entsprechen. Eine erhebliche gegenseitige Löslichkeit verändert die Phasenvolumina und kann Konzentrationen, Verweilzeiten und das effektive Verhältnis von Lösungsmittel zu Zulauf beeinflussen.

Wenn sich die Phasenzusammensetzungen erheblich ändern, sollten gemessene Auslassströme und Konzentrationen anstelle vereinfachter Annahmen konstanter Durchflüsse verwendet werden.

Die Zielkonflikte verstehen

Ein höheres (D) garantiert keinen besseren Prozess

Ein hohes Verteilungsverhältnis begünstigt den Übergang des Enzyms in den Extrakt, stellt jedoch nicht sicher, dass das Enzym aktiv bleibt. Lösungsmitteltoxizität, Grenzflächenkontakt und die nachgeschaltete Lösungsmittelentfernung können den Vorteil einer höheren Gleichgewichtsrückgewinnung überwiegen.

Das Ziel ist daher die Rückgewinnung aktiven Enzyms, nicht lediglich die Übertragung von Proteinmasse in die organische Phase.

Mehr Lösungsmittel verbessert die Rückgewinnung, erhöht aber die Kosten

Eine Erhöhung von (Q_{\text{org}}) steigert das Verhältnis von Lösungsmittel zu Zulauf und verbessert im Allgemeinen die Rückgewinnung in einer Einzelstufe. Sie erhöht jedoch auch den Lösungsmittelverbrauch, die Anlagenbelastung, den Aufwand für die Phasentrennung und die Anforderungen an die nachgeschaltete Lösungsmittelentfernung.

Da sich die Rückgewinnung einem Grenzwert nähert, bietet ein übermäßiger Lösungsmittelstrom oft nur einen begrenzten zusätzlichen Nutzen.

Die Gleichgewichtsrückgewinnung kann die Pilotleistung überschätzen

Die auf (D) basierende Formel sagt das Gleichgewichtsverhalten voraus. Reale Pilotanlagen können aufgrund begrenzter Kontaktzeit, nicht idealer Durchmischung, Kanalisierung, axialer Dispersion, Überflutung oder schlechter Phasentrennung eine geringere Rückgewinnung liefern.

Die gemessene Rückgewinnung sollte als Grundlage für das Scale-up dienen, während die Gleichgewichtsberechnung als Referenzwert verwendet wird.

Analytische Fehler beeinflussen sowohl Rückgewinnung als auch Stoffbilanz

Bei Konzentrationsmessungen müssen die Selektivität des Enzymassays, Fehler bei der Phasenprobenahme, Verdünnung sowie mögliche Interferenzen durch Lösungsmittel oder Polymere berücksichtigt werden. Eine Rückgewinnung von über 100 % weist gewöhnlich auf inkonsistente Messungen von Durchfluss oder Konzentration, Phasenkontamination, eine Assay-Verzerrung oder eine nicht berücksichtigte Quellenkomponente hin.

Eine vollständige Bewertung der Pilotanlage sollte neben der berechneten Rückgewinnung auch den Abschluss der Stoffbilanz ausweisen.

So wenden Sie dies auf Ihr Projekt an

Verwenden Sie die folgende Vorgehensweise bei der Bewertung einer Pilotanlage zur Enzymextraktion:

Wenn Ihr Hauptaugenmerk auf der Rückgewinnung in einer Einzelstufe liegt: Messen Sie (Q_{\text{aq}}), (Q_{\text{org}}), (C_{\text{feed}}) und (D), und berechnen Sie anschließend (\phi= DQ_{\text{org}}/(Q_{\text{aq}}+DQ_{\text{org}})).
Wenn Ihr Hauptaugenmerk auf dem Enzymdurchsatz liegt: Berechnen Sie die Rückgewinnungsrate als (\dot{m}{\text{recovered}}=\phi Q{\text{aq}}C_{\text{feed}}) und geben Sie sie getrennt von der prozentualen Rückgewinnung an.
Wenn Ihr Hauptaugenmerk auf dem Scale-up liegt: Verwenden Sie stufenweise Bilanzen und gemessene Raffinatkonzentrationen und berücksichtigen Sie dabei die Effizienz des Stoffübergangs und der Phasentrennung.
Wenn Ihr Hauptaugenmerk auf der Enzymqualität liegt: Messen Sie die Restaktivität in beiden Auslassphasen, da eine vollständige Proteinrückgewinnung nicht die Rückgewinnung funktionsfähigen Enzyms garantiert.
Wenn Ihr Hauptaugenmerk auf der Prozesswirtschaftlichkeit liegt: Optimieren Sie das Verhältnis von Lösungsmittel zu Zulauf, die Lösungsmittelrückführung, die Phasentrennung und die nachgeschaltete Entfernung von Lösungsmittel oder Polymer gemeinsam.

Zuverlässige Berechnungen der Enzymrückgewinnung verbinden Erhaltungssätze mit experimentell validierten Daten zum Phasengleichgewicht und zur Anlagenleistung.

Zusammenfassungstabelle:

Wichtiger Faktor	Prinzip oder Gleichung	Praktische Bedeutung
Enzym-Zulaufrate	`m_feed = Q_aq C_feed`	Bestimmt die in den Prozess eintretende Enzymmenge.
Stoffbilanz	Enzym im Zulauf = Enzym im Raffinat + Enzym im Extrakt	Bestätigt die Erhaltung und die Berechnungen der Rückgewinnung.
Verteilungsverhältnis	`D = C_org / C_aq`	Zeigt, wie sich das Enzym zwischen den Phasen verteilt.
Rückgewinnung in einer Einzelstufe	`phi = DQ_org / (Q_aq + DQ_org)`	Schätzt die ideale Gleichgewichtsrückgewinnung.
Verhältnis von Lösungsmittel zu Zulauf	`S = Q_org / Q_aq`; `phi = DS / (1 + DS)`	Hilft bei der Optimierung von Lösungsmittelbedarf und Rückgewinnung.
Rückgewinnungsrate	`m_recovered = phi Q_aq C_feed`	Rechnet die Rückgewinnungsquote in den Prozessdurchsatz um.
Leistung mehrstufiger Systeme	Stufenweise Bilanzen sowie Gleichgewichts- oder Verbindungsgeradendaten	Unterstützt das Scale-up für Kolonnen und mehrstufige Kontaktapparate.
Tatsächliche Leistung	Stoffübergang, Mitnahme, Trennung und Assay-Fehler berücksichtigen	Unterscheidet theoretische Rückgewinnung von Pilotanlagenergebnissen.
Enzymqualität	Restaktivität des Enzyms messen	Bestätigt die Rückgewinnung aktiven Enzyms und nicht nur die Proteinübertragung.

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